石蠟切片皮爾斯PERLSDAB非血紅素鐵三價強化染色試劑盒-產品說明書中文版

石蠟切片皮爾斯PERLS-DAB非血紅素鐵三價強化染色試劑盒-產品說明書中文版

技術背景

三價鐵（ferric）是氧化數為三的鐵。通過無機礦物酸（mineral acid）水解，三價鐵從蛋白結合形態中釋放出來。三價鐵具有難溶性的特點。通常三價鐵先被還原使之與有機配位體分離，分離出來的二價鐵被生物體吸收。動物和人體的整個消化道都可以吸收，植物在根尖處吸收。機體大約有三分之二的鐵存在于紅細胞的血紅蛋白和肌肉的肌紅蛋白中，20％的鐵以不同形式存在于肝、脾和其他組織中。鐵作為氧的載體，保證組織內氧的正常輸送，在細胞生物氧化和能量代謝過程中發揮著重要作用。正常脾組織和骨髓里含有少量的三價鐵。組織中過量存在三價鐵，可能與血色病（hemochromatosis）和含鐵血黃素沉著癥（hemosiderosis）有關。由于**神經組織中小膠質細胞（microglia）、少突膠質細胞（oligodendroglia）和神經元（neurons）以及非神經組織含有非血紅素性三價鐵的輕度沉積，使用常規的皮爾斯（PERLS）方法敏感性不足，采用二氨基聯苯胺（3,3’-diaminobenzidine，DAB）的強化擴增效應，分析三價鐵沉積現象。通過酸性氰亞鐵酸鹽（ferrocyanide）與組織中三價正鐵離子（ferric ion）結合，成為亞鐵氰化鐵（ferric ferrocyanide），進而催化二氨基聯苯胺的氧化，電子供體DAB失去電子，而呈現出顏色變化和沉積，形成棕褐色不溶性產物。其反應原理如下：

產品內容

HEPENGBIO脫蠟液（Reagent A）         毫升（自備）

HEPENGBIO補水液A（Reagent B）  毫升

HEPENGBIO補水液B（Reagent C）  毫升

HEPENGBIO補水液C（Reagent D）  毫升

HEPENGBIO補水液D（Reagent E）  毫升

HEPENGBIO清理液（Reagent F）  毫升

HEPENGBIO染色液（Reagent G）  毫升

HEPENGBIO酸性液（Reagent H）  毫升

HEPENGBIO封阻液（Reagent I）  毫升

HEPENGBIO顯色液（Reagent J）  瓶

HEPENGBIO稀釋液（Reagent K）  毫升

HEPENGBIO反應液（Reagent L）  毫升

產品說明書  1份

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保存方式

保存HEPENGBIO顯色液（Reagent J）在-20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；HEPENGBIO染色液（Reagent G）和HEPENGBIO顯色液（Reagent J），避免光照；HEPENGBIO染色液（Reagent G）和HEPENGBIO酸性液（Reagent H）具有腐蝕性和毒性，注意操作**；有效保證6月

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用戶自備

2毫升離心管：用于工作液配制的容器

小型染色缸：用于石蠟切片的脫蠟和染色操作

光學顯微鏡：用于組織細胞染色后觀察分析

實驗步驟

一、 脫蠟處理

1． 取出10片待測的石蠟包埋的5微米厚的組織切片（注意：石蠟包埋前，組織切片須用10％甲醛4℃條件下，固定16小時，此步很重要）

2． （選擇步驟）放進80℃烘箱，孵育30分鐘

3． （選擇步驟）室溫下靜置15分鐘

4． 按下表依次放進小染色缸里孵育

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5． 小心移去切片上的HEPENGBIO補水液D（Reagent E）

6． 小心加上xx微升HEPENGBIO清理液（Reagent F）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面

7． 室溫下孵育5分鐘

8． 小心移去切片上的HEPENGBIO清理液（Reagent F） 

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二、 樣本染色處理

操作開始前，將4℃冰箱里的試劑盒中的HEPENGBIO染色液（Reagent G）和HEPENGBIO酸性液（Reagent H）置入室溫下，分別移出1毫升到2.2毫升離心管，混勻后，標記為HEPENGBIO染色工作液，用錫箔紙包裹，避免光照。然后進行下列操作。

1． 小心加上xx微升HEPENGBIO染色工作液，鋪滿整個切片樣品表面

2． 室溫下孵育30分鐘；或直至可見籃色

3． 小心移去切片上的HEPENGBIO染色工作液 

4． 室溫下，小心將切片置入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent F）中孵育2分鐘

5． 小心移去切片上的HEPENGBIO清理液（Reagent F） 

三、 樣本顯色處理

實驗開始前，將－20℃冰箱里試劑盒中的HEPENGBIO顯色液（Reagent J）取出，加入xx毫升HEPENGBIO稀釋液（Reagent K），混勻，置入冰槽里；然后移取xx微升配制后的HEPENGBIO顯色液（Reagent J）和1.8毫升HEPENGBIO反應液（Reagent L）到2.2毫升離心管，充分混勻，標記為HEPENGBIO顯色工作液，避免光照。 

1． 小心加上xx微升HEPENGBIO封阻液（Reagent I）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面

2． 室溫下孵育20分鐘

3． 小心移去切片上的HEPENGBIO封阻液（Reagent I）

4． 室溫下，小心將切片置入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent F）中孵育2分鐘

5． 小心移去切片上的HEPENGBIO清理液（Reagent F）（注意：須清洗干凈，否則影響下一步操作）

6． 小心加上xx微升配制后的HEPENGBIO顯色液（Reagent J）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面

7． 室溫下孵育20分鐘，避免光照

8． 小心移去切片上的HEPENGBIO顯色液（Reagent J）

9． 小心加上xx微升HEPENGBIO顯色工作液在切片上，鋪滿整個切片樣品表面

10． 室溫下孵育15分鐘，或直至肉眼可見棕黑色沉積，避免光照

11． 小心移去切片上的HEPENGBIO顯色工作液 

12． 室溫下，小心將切片置入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent F）中孵育2分鐘

13． 小心移去切片上的HEPENGBIO清理液（Reagent F）

14． 放上蓋玻片或封片

15． 即刻在一般光學顯微鏡下觀察：三價鐵沉積陽性細胞呈現棕褐色  

注意事項

1． 本產品為50次操作

2． 操作時，須戴手套和防護面罩

3． 建議在通風柜里操作

4． 所有操作在室溫下進行

5． HEPENGBIO脫蠟液（Reagent A）可以使用二甲苯替代

6． HEPENGBIO染色液（Reagent G）和HEPENGBIO酸性液（Reagent H）具有腐蝕性和毒性，注意操作**

7． 石蠟包埋前，組織切片須用10％甲醛4℃條件下，固定16小時，否則造成樣品支離破碎

8． 每次更換試劑溶液時，保持切片面基本晾干。空氣中晾干狀態為沒有水滴，呈濕潤狀態，可見反光

9． 試劑溶液在切片表面時，避免有氣泡存在，同時確保鋪滿切片表面

10． 樣品染色避免過度，肉眼可見棕色即可終止染色

11． 配制后的HEPENGBIO顯色液（Reagent J）避免反復凍融

12． HEPENGBIO顯色工作液不能儲存后使用；如果發現沉淀，不宜使用

13． 組織細胞染色完成后，即刻進行光學顯微鏡觀察 

14． 本公司提供系列組織細胞金屬元素染色試劑產品

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