冰凍切片細胞色素C氧化酶和琥珀酸脫氫酶CombinedCOXSDH雙酶活性染色試劑盒-產品說明書中文版

冰凍切片細胞色素C氧化酶和琥珀酸脫氫酶CombinedCOXSDH雙酶活性染色試劑盒-產品說明書中文版

技術背景

肌肉組織細胞中含有氧化酶，包括細胞色素氧化酶、琥珀酸脫氫酶和NADH四氮唑蘭還原酶（NADH-TR）等，通過組織化學染色，可以呈現低含量（陰性染色）和高含量（深度染色）線粒體狀況，由此分辨肌纖維類型和識別線粒體肌?。?/span>myopathy）。細胞色素氧化酶（Cytochrome oxidase）是氧化呼吸鏈的酶部分的總稱。其存在于真核生物的細胞線粒體上，主要通過氧化磷酸化為細胞提供能量。二氨基聯苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）是人工電子供體染料，通過與金屬蛋白，例如含鐵蛋白細胞色素C中的物理性結合，產生非酶源性自然氧化，同時提供電子（細胞色素C作為電子受體）于呼吸鏈的電子傳遞系統，由此呈現出顏色變化和沉積，形成棕褐色不溶性產物。在DAB自然氧化的同時，產生活性氧，例如過氧化氫，由過氧化氫酶防止其聚集。在大量氧化型DAB的存在下，通過細胞色素氧化酶的作用，亞鐵細胞色素C被氧化成正鐵細胞色素C。由此氧化型DAB棕褐色不溶性產物被用于檢測組織細胞中細胞色素氧化酶的活性。琥珀酸脫氫酶（succinnate dehydrogenase；SDH；EC 1.3.99.1）是三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle；TCA）或Krebs循環中與細胞線粒體膜相關的重要元素，位于線粒體內膜，參與細胞呼吸鏈。其功能在于催化琥珀酸（succinate）的氧化反應，產生延胡索酸（furmarate），通過黃素腺嘌呤二核苷酸（Flavin Adenine Dinucleotide；FAD）傳遞電子?；?/span>琥珀酸脫氫酶的反應原理，使用人工電子受體染料硝基藍四氮唑（Nitro Blue Tetrazolium；NBT），接受來自還原型黃素腺嘌呤二核苷酸（Reduced flavin Adenine Dinucleotide；FADH₂）的電子，而被還原，產生不溶性藍色或藍黑色甲暨色素。使用雙酶染色，可以有效地篩選線粒體**和進行肌纖維分型。 

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產品內容

HEPENGBIO清理液（Reagent A）  XX毫升

HEPENGBIO染色液A1（Reagent B1）  XX毫升

HEPENGBIO染色液A2（Reagent B2）  XX管

HEPENGBIO反應液A（Reagent C）  XX微升

HEPENGBIO染色液B（Reagent D）  XX毫升

HEPENGBIO反應液B（Reagent E）  XX微升

HEPENGBIO固著液（Reagent F）  XX毫升

產品說明書    1份

保存方式

保存HEPENGBIO染色液A和B（Reagent B和D）和HEPENGBIO反應液A和B（Reagent C和E）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

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用戶自備

1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器

培養箱：用于反應孵育

中性樹脂：用于切片封片

光學顯微鏡：用于切片染色后觀察分析

實驗步驟

染色開始前，將－20℃冰箱里的試劑置于室溫下融化；移取XX毫升HEPENGBIO染色液A1（Reagent B1）到XX管HEPENGBIO染色液A2（Reagent B2）里，混勻，標記為HEPENGBIO染色工作液，置于冰槽里備用，避免光照（注意：有效期1周）；繼續移取XX微升HEPENGBIO染色工作液到新的1.5毫升離心管，加入100微升HEPENGBIO反應液A（Reagent C），混勻后，標記為HEPENGBIO反應工作液A，置于冰槽里，避免光照；同時移取XX微升HEPENGBIO染色液B（Reagent D）到新的1.5毫升離心管，加入XX微升HEPENGBIO反應液B（Reagent E），混勻后，標記為HEPENGBIO反應工作液B，置于冰槽里，避免光照。然后進行下列操作。

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1． 取出待測的10微米厚的冰凍組織切片 

2． 小心加上XX微升HEPENGBIO清理液（Reagent A）在切片上，鋪滿整個樣品表面

3． 小心移去切片上的HEPENGBIO清理液（Reagent A）

4． 小心加上XX微升 HEPENGBIO反應工作液A，鋪滿整個切片樣品表面

5． 放進37℃培養箱里孵育30分鐘，避免光照

6． 小心移去切片上的HEPENGBIO反應工作液A

7． 小心加上XX微升HEPENGBIO清理液（Reagent A）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面

8． 小心移去切片上的HEPENGBIO清理液（Reagent A）

9． 重復實驗步驟7至8二次

10． 小心加上XX微升 HEPENGBIO反應工作液B，鋪滿整個切片樣品表面

11． 放進37℃培養箱里孵育15分鐘，避免光照

12． 小心移去切片上的HEPENGBIO反應工作液B

13． 小心加上XX微升HEPENGBIO清理液（Reagent A）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面

14． 小心移去切片上的HEPENGBIO清理液（Reagent A）

15． 重復實驗步驟13至14二次

16． 小心加上XX微升HEPENGBIO固著液（Reagent F）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面

17． 室溫下孵育15分鐘

18． 小心移去切片上的HEPENGBIO固著液（Reagent F）

19． 小心加上XX微升HEPENGBIO清理液（Reagent A）在切片上，鋪滿整個切片樣品表面

20． 小心移去切片上的HEPENGBIO清理液（Reagent A）

21． 重復實驗步驟19至20二次

22． 放上蓋玻片或封片（中性樹脂）

23． 即刻在光學顯微鏡下觀察和計數：

單純表達細胞色素氧化酶活性的組織細胞，呈現棕色

單純表達琥珀酸脫氫酶活性的組織細胞，呈現藍色

同時表達細胞色素氧化酶和琥珀酸脫氫酶活性的組織細胞，呈現棕藍色

注意事項

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1． 本產品為20次操作

2． 建議使用異戊烷（isopentane）快速冷凍組織，避免切片冰晶形成

3． 冰凍切片不宜固定和包埋處理

4． 操作時，須戴手套

5． HEPENGBIO染色液和HEPENGBIO反應液避免反復凍融

6． HEPENGBIO染色工作液不宜久存，1周內使用為佳

7． 每次更換試劑溶液時，保持切片面基本晾干

8． 試劑溶液在切片表面時，避免有氣泡存在，同時確保鋪滿切片表面

9． 整個操作，在避光狀態下進行

10． 染色完成后，即刻進行光學顯微鏡觀察 

11． 樣品染色后保存，避免光照

12． 細胞色素C氧化酶和琥珀酸脫氫酶雙酶雙酶染色參考圖像：

13． 本公司提供系列組織細胞酶活性染色試劑產品

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